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膜蛋白作為一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能關(guān)鍵的生物大分子，在物質(zhì)運輸、信號傳導(dǎo)、能量轉(zhuǎn)換及細胞增殖分化等生命活動中扮演著不可替代的核心角色。正是由于其廣泛而重要的生物學(xué)功能，膜蛋白長期以來是基礎(chǔ)研究與藥物開發(fā)的熱點領(lǐng)域。目前，超過一半的臨床藥物靶點均為膜蛋白，充分彰顯了其巨大的醫(yī)學(xué)價值。然而，膜蛋白固有的結(jié)構(gòu)特性——特別是其疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和嚴格的膜環(huán)境依賴性——使其重組表達成為研究中的主要瓶頸。
某四次跨膜蛋白、七次跨膜蛋白可溶性表達
珀羅汀生物采用PLD無細胞蛋白表達試劑盒(增強版，#PLDK002)，并在體系中加入某非離子型去垢劑，成功實現(xiàn)了某兩個熱門靶點膜蛋白的全長可溶表達。其中，某七次跨膜蛋白的上清液直接進行SDS-PAGE鑒定，目的蛋白條帶清晰可見。
七次跨膜蛋白
四次跨膜蛋白
膜蛋白表達條件快速優(yōu)化
珀羅汀生物受客戶委托，篩選某膜蛋白最佳表達條件。研發(fā)人員通過PCR擴增，分別構(gòu)建目的蛋白表達模板（A組）、C端融合GFP的目的蛋白表達模板（B組），采用專研的針對膜蛋白的CFPS體系（即PLDK002試劑盒來源體系），并設(shè)置是否添加某去垢劑【1】，快速篩選該蛋白的最佳表達條件。
實驗設(shè)計：
組別 | NC | A1 | A2 | B1 | B2 |
是否融合GFP | - | - | - | + | + |
是否添加去垢劑 | - | - | + | - | + |
純化標(biāo)簽 | - | His標(biāo)簽 | |||
注：【1】該去垢劑是依據(jù)珀羅汀生物膜蛋白表達案例庫的實驗數(shù)據(jù)選出。
圖1融合GFP的目標(biāo)膜蛋白在照膠儀下發(fā)出綠色熒光
取反應(yīng)后上清，進行親和純化、表達鑒定。如圖1所示，B1、B2兩組在照膠儀下均發(fā)出綠色熒光，提示融合GFP的目標(biāo)膜蛋白無論是否添加去垢劑，均可在CFPS體系的上清液中可溶表達！
圖2 目標(biāo)膜蛋白SDS-PAGE結(jié)果圖
經(jīng)考染、脫色后，如圖2所示，未融合GFP的目標(biāo)膜蛋白（A1、A2組）同樣在上清液中可溶表達！此外，分別對比A1、A2組與B1、B2組可以發(fā)現(xiàn)，添加去垢劑可促進該膜蛋白的可溶表達。
珀羅汀生物研發(fā)人員構(gòu)建融合了GFP的線性化表達模版，采用自主研發(fā)的PLD無細胞蛋白表達試劑盒（膜蛋白表達增強版，#PLDK002）進行蛋白合成，蛋白合成后采用9種方案進行合適的表面活性劑篩選，對于目的蛋白的表達結(jié)果采用SDS-PAGE進行鑒定。
圖4 目的蛋白表達鑒定
（channel 1：空白對照；channel 2~10：不同方案的目的膜蛋白表達情況；channel 11：marker）
選擇PLDK002-C（channel 3）和PLDK002-I（channel 9） 的無細胞蛋白表達體系進行第二輪優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果顯示，channel 5的無細胞蛋白表達方案可以正確表達該MspA的單體與多聚體。
圖5 MspA目的蛋白表達鑒定
全長CLDN 18.1膜蛋白可溶表達
珀羅汀生物研發(fā)人員構(gòu)建了融合標(biāo)簽的CLDN 18.1質(zhì)粒，選用多種珀羅汀無細胞表達條件體系，進行表達測試。如圖2、圖3所示，CLDN 18.1在不添加表面活性劑的無細胞體系中主要表達在沉淀中；通過在無細胞反應(yīng)體系中加入表面活性劑，CLDN 18.1即實現(xiàn)可溶表達。經(jīng)純化，成功獲得80%以上純度的CLDN 18.1蛋白。
圖2 CLDN 18.1在珀羅汀無細胞體系表達后SDS-PAGE
（S為上清樣，P為沉淀樣）
圖3 CLDN 18.1在珀羅汀無細胞體系表達并經(jīng)Ni珠親和純化后SDS-PAGE（E為洗脫樣）
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